1.抗原或抗體的包被:將需要檢測的生長因子相關抗原或抗體通過物理吸附、離子鍵合或共價結合等方式,均勻地固定在固相載體(如微孔板)表面。這是整個實驗的基礎,其質量直接影響后續步驟的效果。
2.封閉:加入無關蛋白質(如牛血清白蛋白、脫脂奶粉等)或其他封閉劑到固相載體上,以封閉未結合抗原或抗體的空白位點,減少非特異性結合,降低背景干擾。
3.標準品和樣本的準備:根據實驗需求,準備一系列不同濃度的標準品溶液,用于繪制標準曲線。同時,對待測樣本進行適當的處理,如稀釋、離心等,以確保樣本中的待測物質能夠與固相上的抗原或抗體充分反應。
4.一抗的結合:向包被有抗原或抗體的固相載體中加入待測樣本,使樣本中的目標物與固相上的分子發生特異性結合。然后,洗去未結合的雜質,以凈化反應體系。
5.二抗的結合:加入與一抗相對應的酶標二抗,使其與一抗結合,形成抗原-抗體-酶標二抗復合物。這一步可以進一步放大檢測信號,提高檢測的靈敏度。
6.生長因子ELISA試劑盒底物的添加:加入適當的底物溶液,如四甲基聯苯胺(TMB),經辣根過氧化物酶(HRP)催化作用產生顏色變化,從而實現對待測物質的定量檢測。
7.終止反應:在底物反應達到適當程度后,加入終止液(如硫酸)來停止酶反應,使顏色反應穩定下來,便于后續的測量和分析。
8.結果測定與分析:使用酶標儀等儀器測量反應產物的顏色強度或吸光度值,并根據已知的標準曲線計算出樣品中生長因子的濃度或含量。
